細(xì)胞復(fù)蘇講究“快融”，越快融化，細(xì)胞所受損傷就越小。細(xì)胞復(fù)蘇的操作不復(fù)雜，但每一步都必須穩(wěn)扎穩(wěn)打，才能最大限度地提高復(fù)蘇存活率。

細(xì)胞復(fù)蘇步驟

步驟1：水浴鍋預(yù)熱至37℃備用

步驟2：準(zhǔn)備15mL離心管，并向其中加入適量培養(yǎng)基待用

小貼士：離心管中加入4.5~9mL的培養(yǎng)基，比較難養(yǎng)的細(xì)胞，可適量增加培養(yǎng)基。

步驟3：將細(xì)胞凍存管從-80℃冰箱或液氮中取出，放入PE手套中，迅速投入水浴鍋

小貼士：如果冰箱或液氮距離水浴鍋路途較遠(yuǎn)（步行超過(guò)1min），要把細(xì)胞先置于干冰上，再送至水浴鍋。如果將細(xì)胞凍存管直接放在手上或口袋里，可能導(dǎo)致溫度逐漸回升而產(chǎn)生冰晶損傷細(xì)胞。而將細(xì)胞凍存管裝在PE手套中，是為了預(yù)防污染。

步驟4：用力搖晃凍存管，使其在1分鐘內(nèi)融化

小貼士：這一步越快融化越好，最好能放計(jì)時(shí)器在旁邊。如果1分鐘內(nèi)沒(méi)有融化，可能是凍存液量偏多，或者搖晃力度不夠。

步驟5：用紙巾擦拭水漬，轉(zhuǎn)移至生物安全柜。用移液槍吸取細(xì)胞懸液，緩慢滴加到步驟2中準(zhǔn)備好的離心管

小貼士：當(dāng)同時(shí)復(fù)蘇多管細(xì)胞時(shí)，注意不要弄混。

步驟6：1200rpm離心3分鐘

小貼士：離心是為了去除DMSO，對(duì)于DMSO敏感的細(xì)胞，必須離心；若復(fù)蘇的細(xì)胞對(duì)DMSO不敏感，步驟6、步驟7可以省略，直接將培養(yǎng)基補(bǔ)足至10mL，接種至培養(yǎng)器皿中，第二天換液。

步驟7：棄上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種至新的無(wú)菌培養(yǎng)器皿中

細(xì)胞復(fù)蘇操作示意圖

做完步驟7，細(xì)胞就復(fù)蘇好了。復(fù)蘇的細(xì)胞需要一段時(shí)間恢復(fù)狀態(tài)，當(dāng)復(fù)蘇后的細(xì)胞密度低于80%時(shí)，48小時(shí)內(nèi)不要換液，待細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)速度等恢復(fù)正常，再進(jìn)行細(xì)胞傳代等操作。（不要因?yàn)閺?fù)蘇后兩三天細(xì)胞狀態(tài)不好就丟棄，應(yīng)耐心等待至少一周。）

當(dāng)然，細(xì)胞復(fù)蘇后狀態(tài)很好的情況下，可以提前開(kāi)始后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。